تکنیک پی سی آر و کاربرد آن چیست؟

• مقالات آزمایشگاهی

تکنیک پی سی آر چیست؟

واکنش زنجیره ای پلی مراز یا به طور خلاصه پی سی آر تکنیکی است که با استفاده از آن می توان در مدت زمان کوتاهی قطعه خاصی از مولکول DNA را در شرایط آزمایشگاهی میلیون ها بار تکثیر نمود. این قطعه DNA ممکن است یک ژن، بخشی از یک کروموزوم یا بخش هایی از ژنوم یک موجود باشد.

اگر واکنش پلیمریزاسیون در محیط آزمایشگاه در حضور آنزیم پلیمراز صورت بگیرد و منجر به تولید قطعه ای بزرگتر از 5 نوکلئوتید شود به آن PCR اطلاق می شود. البته در تکثیر DNA با روش PCR محدودیت هایی نیز وجود دارد که مهم ترین آن اندازه قطعات قابل تکثیر می باشد. به طوری که حداکثر اندازه قطعه هایی که با روش PCR معمولی تکثیر می گردد، 5 هزار نوکلئوتید (5kb) و در روش های بهینه شده تا 20 هزار نوکلئوتید (20kb) می باشد .

تاریخچه تکنیک پی سی آر

در سال 1971خورانا و همکارانش روشی را برای همانند سازی یک ناحیه از DNA دو رشته ای با استفاده از دو پرایمر ساخت DNA گزارش نمودند که در آن انتهای دو پرایمر به سمت یکدیگر طراحی شده بود . ولی ایده استفاده از این خاصیت به صورت چرخه های تکراری در یک واکنش تکثیر تا 12 سال بعد ارائه نشد.

گاهی یک ایده خوب زمانی به ذهن شما می رسد که انتظارش را ندارید این جمله آغازین گزارش کری مولیس ، مخترع پی سی آر ، در مجله Scientific American در مورد این که اینگونه در هنگام رانندگی در کوه های کارولینای شمالی در بهار 1983 ایده راه اندازی پی سی آر به ذهن وی الهام شد می باشد.

اولین آزمایش های عملی پی سی آر در شرکت ستوس انجام شد که مولیس برای آن شرکت کار می کرد و پس از اختراع آن یکی از اصلی ترین منابع درآمد این شرکت بود تا اینکه در 1991 این شرکت امتیاز استفاده از پی سی آر را به قیمت 300 میلیون دلار واگذار نمود.

از زمانی که کاربردهای بالقوه PCR مشخص شده است، به دلیل مبالغ مالی زیادی که در زمینه حق امتیاز آن مبادله می شود استفاده ازآن در پیچ و خم مسائل تجاری گیر کرده است. حقوق تجاری این اختراع اینک به شرکت هافمن–روچت تعلق دارد .

شایان ذکر است در سال 1993 مولیس به دلیل این اختراع موفق به کسب جایزه نوبل شیمی شد.

واکنش زنجیره ای پلیمراز چیست؟

این تکنیک تمامی مشکلات قبلی در زیست مولکولی که ناشی از عدم دسترسی به مقادیر زیاد از DNA یکسان بود را برطرف نمود. برای مثال قبلا برای به دست آوردن نسخه های متعدد از یک ژن خاص می بایست این ژن را به داخل حامل مناسب وارد نموده و در یک باکتری تکثیر کنند. ولی امروزه این کار را به سادگی و با استفاده از PCR انجام می دهند. اگر واکنش پلیمریزاسیون در محیط آزمایشگاه در حضور آنزیم پلیمراز صورت بگیرد و منجر به تولید قطعه ای بزرگتر از ۵ نوکلئوتید شود به آن PCR اطلاق می شود.

PCR از فرآیندهای طبیعی داخل سلولی همانندسازی DNA الگوبرداری شده است و تلاش می کند کلیه فرآیندهایی را که در طی همانند سازی در درون سلول رخ می دهد را در درون آزمایشگاه شبیه سازی کرده و مورد استفاده قرار دهد. به این صورت که در داخل سلول هنگام همانند سازی ابتدا باید DNA تک رشته ای شده و این تک رشته DNA به صورت پایدار باقی بماند. در داخل سلول آنزیم های مختلفی وظیفه تک رشته ای کردن و وظیفه پایدار نگه داشتن DNA را بر عهده دارند. اما در محیط آزمایشگاه برای انجام PCR ما به جای این آنزیم ها از حرارت برای تک رشته ای کردن DNA استفاده می کنیم. با ادامه روند PCR از تعداد کپی های اولیه یک قطعه DNA، که ممکن است یک یا تعداد بسیار کمی باشند، به عنوان الگو استفاده شده و به میزان بسیار زیادی در حد چندین میلیون کپی تولید می گردد. محصول نهایی PCR را آمپلیکون می گویند که به معنی ماده تقویت شده یا آمپلی فایر شده است.

کاربرد PCR

واکنش PCR به طور روزمره در اکثر آزمایشگاه های تشخیصی و تحقیقاتی استفاده میشود و در موارد بسیاری مانند شناسایی و جداسازی ژن ها، تهیه نسخه های متعدد از یک ژن، کلونینگ، بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن خاص در یک قطعه DNA طبقه بندی و شناسایی موجودات زنده، تعیین جنسیت جنین، تشخیص بیماری های ژنتیکی، تشخیص جهش ها و سرطان ها و حتی پرونده های جنایی و تعیین هویت کاربرد دارد. در حال حاضر و با گذشت نزدیک به ۳۰ سال از کشف PCR تحقیقات ژنتیک مولکولی بدون استفاده از این تکنیک قابل تصور نمی باشد.

اصول و مبانی PCR

اساس این روش بسیار ساده بوده و مانند واکنش همانندسازی DNA در موجودات زنده، توسط آنزیم DNA پلیمراز صورت می گیرد. در موجودات زنده، مجموعه ای از چند پروتئین و آنزیم در فرآیند همانند سازی DNA نقش دارند. در حالی که در واکنش PCR تنها نوع خاصی آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت به نام تک پلیمراز به همراه بافر کلرید منیزیم و نوکلئوتیدها جهت تکثیر قطعات DNA مورد استفاده قرار می گیرند.

واکنش زنجیره پلیمراز مبتنی بر تکثیر آنزیمی قطعه ای از DNA می باشد که با استفاده از آغازگر صورت می گیرد. طول آغازگر می بایست به اندازه کافی بزرگ باشد تا توالی های مشابه به آنها در نواحی غیر هدف یافت نشود.

اجزا واکنش PCR

در یک واکنش PCR از نمونه DNA آنزیم تک پلیمراز، پرایمرها، بافر، یون منیزیم، نوکلئوتیدها و آب استفاده میشود.

پرایمرها دو کار انجام میدهند:

1. اندازه قطعات تکثیر شونده را مشخص می کنند (محل ژنی که باید تکثیر شود را مشخص می کنند)
2. بعد از اتصال آغازگر به مکمل های خود در توالی هدف ، انتهای هیدروکسیل ۳ آنها رو به سوی ناحیه هدف قرار می گیرد.

آنزیم تک پلیمراز به یک باکتری مقاوم به حرارت تعلق دارد و رایج ترین آنزیمی است که در PCR به کار می رود. البته این آنزیم قدرت برگشت و تصحیح اشتباه خود را ندارد، در نتیجه احتمال خطا در همانندسازی زیاد می شود. بنابراین در کارهای حساس مثل ساخت یک ژن به کار نمی رود و بیشتر برای تشخیص بیماری ها کاربرد دارد.

آنزیم دیگری به نام PFU وجود دارد که برای کارهای حساس می توان از آن استفاده نمود. این آنزیم یک DNA پلیمراز مقاوم به حرارت می باشد و قدرت برگشت و تصحیح اشتباه خود را دارد.

مراحل یک چرخه PCR

PCR طی سه مرحله (دوره متوالی) صورت می پذیرد:

1. واسرشت سازی رشته الگو
2. اتصال آغازگر (باز پخت)
3. بسط یا ازدیاد طول که توسط آنزیم پلی مراز انجام می شود.

این ۳ مرحله (دوره) بین ۲۵ تا ۷۵ بار تکرار میشود و به آن چرخه های PCR می گویند .هر یک از دوره های ذکر شده به شرح ذیل می باشند:

• مرحله واسرشت سازی رشته الگو
  در این مرحله که ۱۵ تا ۶۰ ثانیه به طول میانجامد DNA هدف بر اثر حرارت c° ۹۴ تا c° ۹۷ تک رشته ای می شود.
• مرحله اتصال آغازگر
  در این مرحله که بین ۳۰ تا ۶۰ ثانیه طول می کشد، با کاهش حرارت سیستم به میزان 47 تا 60 درجه ، پرایمرهای الیگو نوکلئوتید به محل مناسب روی رشته مکمل متصل میشوند.
• مرحله بسط یا ازدیاد طول
  در این مرحله که ۳۰ ثانیه تا ۳ دقیقه زمان می برد، دما به ۷۲ درجه رسیده و شرایط مطلوبی برای آنزیم DNA پلیمراز فراهم می شود تا موجب توسعه پرایمرهادشده و همانند سازی DNA هدف انجام شود. مدت زمان این مرحله وابسته به سرعت آن به DNA پلیمراز می باشد.

تفاوت PCR با روش همانندسازی در بدن

همانند سازی در بدن در دمای ۳۷ درجه و توسط آنزیم DNA پلیمراز و آنزیم های دیگر انجام می شود، در حالی که در PCR با توجه به استفاده از درجه حرارت بالا برای واسرشت نمودن رشته DNA از آنزیم های مقاوم به حرارت مانند Taq استفاده نموده و به جای سایر آنزیم ها نیز از تغییرات درجه حرارت استفاده می نمایند.

مقایسه تکثیر ژن از طریق کلونینگ با PCR

1. در روش کلونینگ برای تکثیر قطعه DNA هفته ها یا حتی ماه ها وقت لازم است، در حالی که در PCR تولید قطعات خاص DNA از ژنومی پیچیده، ظرف چند ساعت انجام میشود.
2. در PCR مقادیر بسیار کمی از DNA برای تکثیر مورد نیاز است. درحالی که در روشهای استاندارد کلونینگ و تجزیه و تحلیل های بیولوژی مولکولی نیازمند چند میلیون قطعه از DNA هستیم.
3. تکثیر DNA در کلونینگ نیازمند سلولهای زنده می باشد ولی PCR در محیط عاری از سلول انجام میشود.
4. خلوص DNA برای PCR اهمیت زیادی ندارد ولی در کلونینگ، DNA تا حد امکان باید خالص باشد.
5. یکی از مزایای PCR نسبت به کلونینگ سرعت آن میباشد. در PCR ، تک پلیمراز می تواند توالی بیش از هزار جفت باز را در ظرف مدت کمتر از یک دقیقه تکثیر نماید.
6. در PCR نیازی به جدا کردن قطعه مورد نظر از محل استقرارش در DNA نمی باشد در حالی که این محدودیت در روش های کلونینگ وجود دارد.

لوازم مورد نیاز برای واکنش PCR

حداقل وسایل مورد نیاز برای انجام واکنش PCR شامل موارد زیر می باشد:

1. دستگاه ترموسایکلر (ایجاد کننده چرخه های دمایی).
2. میکرو پی پت
3. ظرف یخ
4. وسایل یک بار مصرف
5. لوله های درب دار کوچک، در دو اندازه بر اساس گنجایش آنها یعنی ۲۰۰ul و ۵۰۰ul، که واکنش PCR در آنها انجام میشود.
6. ظروف نگهداری

دستگاه ترموسایکلر

دستگاه ترموسایکلر قابل برنامه ریزی بوده و توانایی ایجاد دماهای مختلف با قابلیت تنظیم زمان دلخواه را دارد. قبل از تولید این دستگاه، برای انجام PCR به طور دستی، از سه حمام آب گرم با دماهای مختلف استفاده می نمودند که کار بسیار پر زحمتی بود.

انواع PCR

روش های انجام پی سی آر را به 9 گروه به شرح ذیل تقسیم بندی می نمایند.

1. نامتقارن
   هدف از به کارگیری این روش تولید DNA تک رشته ای می باشد. در این روش یکی از پرایمرها به تعداد کمتر و پرایمر دیگر به تعداد بیشتر به محیط واکنش اضافه می شود. در 20 ثانیه چرخه ابتدایی پی سی آر محصول دو رشته ای تولید و پس از آن به دلیل تمام شدن یکی از پرایمرها، فقط یک رشته از الگو به صورت خطی تکثیر می شود. به این ترتیب در پایان کار، تعداد محدودی DNA دو رشته ای و تعداد زیادی DNA تک رشته ای از ژن مورد نظر تولید خواهد شد.
2. ARMS
   این روش تحت عنوان تکثیر اختصاصی الل ها (الل ها نسخه های مختلفی از یک ژن می باشند) توسط PCR نیز نامیده می شود. از این روش برای تشخیص الل ها طبیعی و جهش یافته و تشخیص موتاسیون های مولد مقاومت دارویی در باکتری ها استفاده می شود. این روش بر پایه تفاوت نوکلئوتید انتهای 3 پرایمر ها ، برای الل های مختلف طراحی شده.
   در واقع دو واکنش پی سی آر در دو لوله جداگانه و با استفاده از یک DNA الگو انجام می شود که یکی از آن ها حاوی پرایمرهای جهش یافته و دیگری حاوی پرایمر طبیعی می باشد. چنانچه پلیمریزاسیون در لوله حاوی پرایمر طبیعی انجام شود نشان دهنده نبود جهش نقطه ای و اگر پلیریزاسیون در لوله حاوی پرایمر جهش یافته انجام شود نشان دهنده حضور جهش نقطه ای در باز مورد نظر می باشد.
3. Hot Start
   از آنجایی که ممکن است هنگام افزایش دمای لوله ها باندهای غیر اختصاصی پرایمر/پرایمر و یا پرایمر/الگو تشکیل شوند و به عنوان سوبسترای اولیه برای DNA پلیمراز عمل کنند، از این روش برای جدا نمودن فیزیکی مواد واکنش زا و جلوگیری از ایجاد باندهای غیر اختصاصی قبل از انجام اولین چرخه PCR استفاده می شود. اولین و ارزانترین راه، اضافه نمودن تمامی مواد واکنش به جز DNA پلیمراز می باشد. راه دیگر استفاده از محصولات تجاری مانند AmpliwaxGems میباشد که گلوله های مومی با فرمول خاص می باشند. لایه موم به عنوان یک سد در برابر تبخیر آب درحین چرخه های دمایی عمل نموده و همچنین به عنوان یک مانع فیزیکی، برای جلوگیری از آلودگی استفاده میشود.
4. RT
   از این روش برای تکثیر ماده ژنتیکی ویروسهای RNA دار مانند HIV استفاده میشود. الگوی اولیه در این روش مولکول RNA تک زنجیره ای می باشد. از آنجائی که DNA پلیمراز قادر به استفاده از RNA به عنوان الگو نمی باشد، مرحله ی دیگری به PCR اضافه شده که طی آن با استفاده از آنزیم RT از الگوی RNA، مکمل آن یعنی cDNA سنتز میشود و سپس به وسیله تکنیک PCR از DNA که خود ساخته استفاده و آن را تکثیر می نماید. آنزیم نسخه بردار معکوس در این روش از ویروس میلوبلاستومای مرغ و یا باکتری ترموفیلوس تهیه می شود.
5. RAPD
   این روش تحت عنوان PCR با پرایمرهای قراردادی نیز نامیده میشود و یک روش سریع برای انگشت نگاری ژنومی می باشد. انگشت نگاری ژنومی در تحقیقات جنایی، جرم شناسی، پزشکی قانونی برای تعیین والدین و روابط پدر فرزندی و تعیین روابط خویشاوندی نقش تعیین کننده ای دارد.
   در این روش تنها از یک پرایمر چند نوکلئوئیدی کوتاه (۱۰-۹ نوکلئوئید محتوی ۵۰٪ GC)، برای ساخت DNA از روی ناحیه ای از DNA الگو، استفاده میشود. RAPD-PCR براساس تکثیر تصادفی در دمای پایین انجام میشود. چرخه های ابتدایی (معمولا برای ۵ چرخه اولیه) باید در دمای پایین بین ۳۷°C تا ۵۰°C انجام شود تا پرایمر به جایگاههای تصادفی در داخل ژنوم متصل شوند. سپس دما تا ۵۵°C افزایش می یابد و واکنش برای ۳۰ تا ۳۵ چرخه دیگر ادامه می یابد. در واقع تنها جایگاههای مناسب تر از بین جایگاه های تصادفی اولیه تکثیر خواهند شد. این روش تکنیکی عالی در فیلوژنتیک یا شجرہ شناسی می باشد.
6. داخلی یا لانه ای
   این روش به منظور افزایش حساسیت و دقت PCR و برای جداسازی محصول اختصاصی مورد نظر از بین انبوه محصولات غیر اختصاصی به کار می رود. در این روش از دو جفت پرایمر به صورتی که جفت دوم در بین جفت اول قرار گرفته استفاده شده است. در ابتدا پرایمر اول (پرایمر بیرونی) اضافه شده که این امر موجب تکثیر قطعاتی از DNA میشود. تعدادی از این قطعات تکثیر شده محصولات غیراختصاصی خواهند بود. محصول PCR واکنش اول به عنوان DNA الگو برای PCR دوم در حضور پرایمرهای داخلی (پرایمر دوم) که مکمل قسمت داخلی تر قطعه DNA مورد نظر است مورد استفاده قرار می گیرند. این امر سبب افزایش نسبت محصول اختصاصی به محصول غیر اختصاصی خواهد شد، اگرچه هم پوشانی قابل توجهی بین پرایمرهای داخلی با پرایمرهای اولیه وجود دارد، اما استفاده از این روش سبب تکثیر اختصاصی توالی هدف و حذف محصولات غیر اختصاصی خواهد شد.
7. معکوس
   این روش برای شناسایی جایگاه های اتصال ویروسها و ترانسپوزونهایی که به طور تصادفی در ژنوم ادغام می شوند مناسب می باشد. این روش تکثیر برای قطعه ای از DNA استفاده میشود که هیچ اطلاعاتی در مورد توالی پایانه های آن به جز توالی قسمتی از ناحیه درونی در دست نمی باشد. برای این منظور DNA ژنومی با استفاده از آنزیم مناسب هضم شده و سپس مجددا مولکولهای آن برای به دست آوردن قطعات DNA حلقوی به یکدیگر متصل می شوند، با تکرار عمل هضم آنزیمی نواحی ناشناخته بین ۲ ناحیه شناخته شده حاصل از هضم آنزیمی قرار می گیرند. حال با طراحی پرایمر مناسب برای توالی شناخته شده می توان نواحی ناشناخته را تکثیر نمود.
8. چندتایی
   در این تکنیک از چندین جفت پرایمر اختصاصی در یک محلول PCR جهت تکثیر چندین توالی هدف در یک زمان استفاده میشود بنابر این می توان با آزمایشات کمتر و زمان کوتاه تر اطلاعات بیشتری جمع آوری نمود.
   انواع PCR چندتایی
   دو نوع داریم یکی PCR با یک الگو و دومی PCR با چند الگو که در ادامه راجع به هرکدام توضیحاتی داده خواهد شد.
   1- واکنش PCR با یک الگو
   در این روش یک DNA الگو در طول خود با چندین جفت پرایمر برای تکثیر نواحی مخصوص جفت میشود. با توجه به این که محصولات به دست آمده اندازه متفاوت دارند، بخش های بزرگی از یک DNA هدف جهت جستجوی تغییرات می تواند بررسی شود.
   2- واکنش PCR با چند الگو
   با استفاده از این روش امکان شناسایی چندین عامل بیماری زا در یک نمونه از عفونتهای متفاوت به طور هم زمان وجود دارد. در این روش با استفاده از پرایمرهای مختلف و ویژه به جستجوی عوامل مختلف بیماری زا پرداخته تا منشاء عفونت مشخص شود. از آنجائی که در این تکنیکها از چندین پرایمر استفاده میشود رعایت نکات زیرضروری است:
   ۲-۱) پرایمرها را باید به گونه ای طراحی نمود که دارای دمای ذوب یکسانی باشند و یا اختلاف دمای ذوب پرایمرها بیش از ۳°C الی ۵°C نباشد.
   ۲-۲) پرایمرهای طراحی شده برای توالی هدف میبایست اختصاصی باشند.
   ۳-۲) به علت این که دیمر شدن پرایمر منجر به تکثیر محصولات غیر اختصاصی میشود، پرایمرهای طراحی شده باید از نظر امکان تشکیل دیمر پرایم با همه پرایمرهای حاضر در مخلوط واکنش مورد بررسی قرار گیرد.
9. Real time PCR
   در این سیستم تشخیصی، یک ماده فلورسنت در طی واکنش متناسب با میزان محصولات هرسیکل آزاد میشود و میزان فلورسنت آن توسط دتکتور شناسایی و ثبت می گردد. به این ترتیب میزان DNA تکثیر شده طی یک چرخه تا چرخه بعدی را می توان اندازه گیری نمود. بنابراین میزان محصول در هر چرخه قابل ردیابی میباشد. در حالی که در روشهای سنتی، محصول پس از پایان واکنش و الکتروفورز مشخص می شود. روشهای سنجش با Realtime به شرح زیر میباشد:
   1- استفاده از رنگهای فلورسنت مثل سایبر گرین
   رنگ سایبرگرین هم زمان با دو رشته ای شدن DNA به شیار کوچک DNA متصل شده و در طول موج 498nm و 522nm نور فلورسنت ساطع می کند. میزان فلورسانس تولید شده متناسب با مقدار DNA دو رشته ای در واکنش می باشد. یکی از مهم ترین ایرادات این روش عدم اختصاصی بودن آن می باشد. لذا احتمال اتصال ماده رنگی به باندهای غیر اختصاصی DNA و پرایمر دیمر زیاد بوده و این امر موجب افزایش کاذب نتایج می شود.
   2- استفاده از پروب های فلورسنت
   پروب های فلورسنت بر خلاف رنگ سایبر گرین بر اساس تشخیص اختصاصی توالی محصول، عمل می نماید. دو نوع از پرکاربردترین پروب ها در این روش یکی پروب تک من و دومی پروب بیکن می باشد. این پروب ها دارای یک رنگ فلورسنس زا در یک انتها و یک رنگ خاموش کننده در انتهای دیگر خود می باشند که در اثر نزدیک شدن آنزیم و فعالیت آن لیز شده و در نتیجه رنگ فلورسانس از عامل خاموش کننده جدا شده و ایجاد فلورسانس می نماید.