توضیحات
روش کار با دستگاه اسپکتروفتومتر
لازمه روش کار با دستگاه اسپکتروفتومتر ابتدا جداکردن عوامل مزاحم از محلول می باشد. برای تعیین مقدار یک ماده باید سعی کنیم حتی المقدور مواد مزاحم را از محیط آزمایش دور کنیم. تا از پیدایش رنگهای بیگانه و مزاحم جلوگیری گردد. برای این منظور در اغلب اندازه گیری ها به کمک ترکیبات مختلف، پروتئین های خون یا پلاسما را رسوب داده و واکنش را بر روی محلول صاف شده انجام می دهند. یا اینکه بعضاً به کمک حلالهای مناسب، ماده مورد اندازه گیری را از سرم جدا می کنند.
طول موجهای مختلف، تولید رنگهای مختلفی را می نمایند و در اسپکتروفتومتری انتخاب طول موج براساس رنگ محلول رنگی صورت می گیرد. یعنی باید طول موجی را انتخاب نمود که رنگ آن مکمل رنگ محلول باشد. به عنوان مثال اگر یک محلول رنگی داشته باشیم و نوری از آن عبور دهیم مقداری از این نور جذب می شود که این نور جذب شده دارای رنگ مکمل رنگ محلول می باشد. که این مقدار بستگی به غلظت محلول رنگی دارد. لذا روش کار با دستگاه اسپکتروفتومتر بوسیله فیلتر و یا منشور و … نور تکرنگ ایجاد می نمایند. تا بتوان غلظت یک محلول رنگی (خاصی) را محاسبه کرد. محلولهای رنگی در رنگ مکمل خود حداکثر جذب نور را دارند و بر حسب همین خاصیت مربوط به خود مورد مطالعه قرار می دهند. و شدت و ضعف این رنگ بستگی به مقدار ماده موجود در محلول مواد را در طول موجهای دارد.
محلولهای مورد استفاده در روش کار با دستگاه اسپکتروفتومتر
محلولهای استاندارد (standard)
در جذب ابتدا باید واکنش رنگی را با محلولهای دارای غلظت معین (محلول st) داده و منحنی تغییرات دانسیته اپتیک را نسبت به غلظت های مختلف رسم نمود. در صورتیکه منحنی تغییرات خطی باشد (یعنی جذبنوری محلول رنگی از قوانین جذب نوری تبعیت نماید) می توان هنگام اندازه گیری یک ماده در مایع بیولوژیک با روش رنگ سنجی فقط از یک دو محلول استاندارد (استاندارد رقیق و غلیظ) استفاده نموده و مقدار ماده را در مایع بیولوژیک با استفاده از رابطه زیر محاسبه نمود:
محلولهای شاهد (Blank)
محلولی است محتوی تمام مواد بکار برده شده در آزمایش، به جز ماده مورد اندازه گیری. در تعیین مقدار یک ماده در مایعات بیولوژیک، با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر باید ابتدا با محلول شاهد، عقربه گالوانومتر را روی عدد صفر تنظیم کرد.
اجزا دستگاه اسپکتروفتومتر :
دستگاه اسپکتروفتومتر شامل بخشهای زیر می باشد: منبع نور ، موازی ساز(عدسی) ، تک فام ساز (منوکروماتور) ، گزینشگر طول موج ، جایگاه کووت یا سل، سل یا دتکتور و مانیتور (photocell) فتوالکتر.
خصوصیات منبع انرژی:
• منبع انرژی باید پرتو تولید شده اش دارای انرژی کافی باشد تا در مراحل بعد بتواند دتکت شود (مورد سنجش قرار گیرد).
• تولید طیف پیوسته نماید (یعنی حاوی تمام طول موجها باشد).
• پایدار باشد (یعنی قدرت امواج در طول کار تغییر نکند).
انواع منبع انرژی :
• لامپ تنگستن
• لامپ هیدروژن یا دوتریوم
• لامپ جیوه ای
منوکروماتور (تک فام ساز) :
تجزیه کننده اشعه نوری می باشد و باعث ایجاد نور تک رنگ می گردد . دارای انواع زیاد می باشد که فیلترها، منشورها، گراتین گ ها از آن جمله اند. فیلترها م منشورها اکنون کابرد چندانی ندارند. گراتینگ ها یک سری صفحات شیشه ای شفاف اند و یا غیر (grating) شیشه ای ممکن است باشند. بوسیله دستگاههای تراش حدود 15000 تا 30000 شیار در هر اینچ بر روی آنها قرار می دهند (حدود 10000 در هر cm ) وقتی نور به آنها برخورد می نماید هر کدام از آنها مانند یک منشور عمل می کند و نور را تجزیه می کند.
سلول نمونه یا کووت :
خصوصیاتی که در روش کار با دستگاه اسپکتروفتومتر باید توجه داشت این است که یک کووت باید داشته باشد به شرح زیر است:
• باید نور تابشی را جذب نکند.
• باید جنس آن از کوارتز یا سیلیکا باشد (برای امواج مرئی از کووت شیشه ای می توان استفاده کرد). (UV) برای ناحیه ماوراءبنفش است.قطر آن بستگی به دستگاه دارد ولی معمولاً 1 سانتی متر. شکل آن عموماً استوانه ای یا مکعبی می باشد.
خصوصیات دتکتور:
• حساس به دامنه وسیعی از طول موجها باشد.
• حساسیت نسبت به تابشهای کم انرژی.
• عکس العمل آنی نسبت به تشعشع های مختلف داشته باشد (سریع عمل کنند).
• عکس العمل الکتریکی که در دتکتور ظاهر می شود مستقیماً متناسب با انرژی تابش شده باشد.
انواع اسپکتروفتومتر :
• اسپکتروفتومتر تک کووتی
• اسپکتروفتومتر دوکووتی
